技术领域
本发明属于生物肥料领域，涉及一种新型地衣芽孢杆菌菌株及其在农作物中生产中的应用。
背景技术
芽孢杆菌属细菌是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆内生孢子的杆状细菌，以营腐生生活，在自然界中广泛存在主要分布在土壤、植物体表面及水体中，生长快、营养简单、极易分离和培养，抗逆能力强、耐热、耐干、抗紫外线、抗电磁辐射、繁殖速度快、易定殖在植物表面。芽孢杆菌作为一种重要的微生物资源，它富含蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶类以及其他丰富的代谢产物，部分菌还可以分解土壤中的不溶性磷酸盐，与其他微生物一起在土壤中起着重要作用。
地衣芽孢杆菌不仅在工业、医药有广泛的应用，在农业生产中防治植物病害同样有一定的利用价值，是一个非常有潜力的生防菌株。地衣芽孢杆菌可代谢产生抗菌蛋白质和抗生素(几丁质、抗菌蛋白、多肽类、苯乙酸，已报道有明显抑病作用有小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、番茄早疫病(Alternariasolani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)等。
黄皮(学名：Clausena lansium)，是芸香科植物，为常绿小乔木，高5至10米。黄皮春季开花，白色小花，有芳香。果实夏秋成熟，卵形，长1至3厘米，横径1至2厘米，果实多汁，味酸甜，内有三至四粒绿色的种子。黄皮是热带、亚热带水果，原产于中国南部，主要是云南、广东、广西和海南等地，营养丰富，用途广泛，经济价值高。近年来，黄皮种植业迅速发展，种植规模不断扩大。然而，目前黄皮种植园施用的肥料以氮、磷、钾肥为主，容易导致果实品质差、经济效益低，并造成环境污染。急需开发研究环保、高效、低成本的生物肥，以促进黄皮种植业健康发展。
从植物的根分离并培养与根共生的土壤微生物，然后将其与植物接种或者制备成菌剂或生物肥施与植物生长的土壤，促进植物根系的发育，从而促进植物的生长和结实，是目前研究的热点。
但目前应用于黄皮或其他植物种植方面的生物菌株或生物菌剂的技术仍属空白，未见任何技术报道。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种具有固氮、耐高温的新型地衣芽孢杆菌菌株。
本发明的另一个目的是提供所述菌株的培养方法。
本发明还有一目的是提供所述菌株在农作物生产中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种新型地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis lx2-4)，于2010年6月4日保存在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3911。
本发明新型地衣芽孢杆菌具有如下形态和生理、生化特性：
a、菌体形态特性
新型地衣芽孢杆菌的细胞为革兰氏阴性菌，杆状，大小为(0.8-1.2)×(1.2-2.5)μm。
b、菌落形态特性
在Nfb固体培养基平板上培养72h后，菌落形态为圆形或圆锥状，表面光滑呈粘液状，边缘整齐，透明，菌落大小为2～3mm。
c、主要生理生化特性
兼性厌氧，甲基红试验，脲酶测定阴性；产吲哚，乙酰甲基甲醇试验(V.P.试验)，硝酸盐还原，过氧化氢活性，产氨试验，明胶水解，淀粉水解，纤维素水解均呈阳性反应。
本发明所述地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis lx2-4)具有SEQ ID NO.1所示16S rDNA序列。
本发明新型地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)的分子分类地位的确定：
采用细菌16S rDNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank进行比对，结果发现本发明的新型地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)属于芽孢杆菌属，与地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis))式菌株IAM13417有98％的相似性。SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR指纹图谱分析表明，序列分析表明本发明的地衣芽孢杆菌菌株(Bacilluslicheniformis lx2-4)与地衣芽孢杆模式菌株IAM 13417存在着较大差异，应为地衣芽孢杆菌中的一个新亚种。
结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析结果，本发明的新型地衣芽孢杆菌应归属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，是地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)的一个新亚种。其判断方法参考如下文献：Wei et al，Appl Biochem Biotechnol，2010，160(5)：1332-1340；Bezawada et al，Environ Technol，2010，31(1)：63-72；Xiong et al，ApplEnviron Microbiol，2010；Liu et al，Bioresour Technol，2010，101(14)：5528-5533；Songsiriritthigul et al，Bioresour Technol，2010，101(11)：4096-4103；Manocha and Margaritis，Biotechnol Prog，2010；Zhang et al，Prep Biochem Biotechnol，2010，40(1)：65-75；Tourney et al，J ColloidInterface Sci，2009，337(2)：381-389；Li et al，Bioresour Technol，2009，100(14)：3650-3656；Banyko and Vyletelova，Lett Appl Microbiol，2009，48(3)：318-323；Emptage et al，Biochem Pharmacol，2009，77(1)：21-29。
本发明提供了所述菌株的培养方法，通过采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，对生长于广东番禺土壤的黄皮植物根中分离得到的内生固氮菌进行分离、纯化，得到新型地衣芽孢杆菌属的一个新种，经过研究发现它具有固氮、耐高温，可作为接种剂促进黄皮、油麦菜及其它作物生长和抗病能力。
具体来说，本发明菌种的分离纯化方法如下：
将生长于番禺土壤的黄皮植物根新鲜样本用蒸馏水洗净，然后剪下根置于已灭菌的三个培养皿中，用3％(体积百分比浓度)的双氧水(H2O2)浸泡3～5min，以除去根表面的腐烂物质，无菌水洗涤一次，再用0.1％(质量百分比浓度)的升汞(HgCl2)浸泡，无菌水中振动洗涤5～7次，每次5～10min，并将最后一次洗涤液涂布于固休培养基，以检测消毒是否彻底。
将表面消毒完全的根用已灭菌手术刀切碎，分别接种到三支装有5mlNfb半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于28℃的人工培养箱内进行培养。整个操作均在无菌条件下完成。
待长出菌体后，向管内注入1/10体积的混合气，混合气为体积百分比10％的乙炔气体和90％的空气，(乙炔气体体积计百分比终浓度为1％)，在相同条件下(28℃的人工培养箱)再培养24h，测定其固氮酶活性(乙炔还原法)。
将具有固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，以检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态及确定纯化与否。
Nfb培养基构成：malic acid(苹果酸)5.0g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，CaCl20.02g/L，0.5％bromthymolblue 2.0mL/L(先溶解在0.2N KOH溶液中)，vitamin solution(维生素液)1.0mL/L，micronutrient solution(微量元素液)2.0mL/L，1.64％Fe-EDTA solution 4.0mL/L，KOH 4.5g/L，pH＝6.8。其中vitamin solution(维生素液)组成为：biotin(生物素)100.0mg/L，pyridoxol-HCl(盐酸吡哆醇，维生素B6)200.0mg/L；micronutrient solution(微量元素液)组成为：CuSO40.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.12g/L，H2BO31.4g/L，Na2MoO4·2H2O 1.0g/L，MnSO41.5g/L。固体培养基中加入1.7％的琼脂，半固体培养基中加入0.15～0.25％的琼脂。
本发明同时提供了所述菌株的应用。
本发明的菌种可作为接种剂或生物肥料，例如可将分离纯化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，菌数达2.5×109，CFU.mL-1，用蛭石作载体。将地衣芽孢杆菌菌液与蛭石(2∶1)混合，制备成菌数达1～2×109CFU.g-1的菌剂，将接种剂或生物菌肥施用于种植作物的土壤中，可有效促进黄皮、油麦菜及其它作物生长和抗病能力。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的地衣芽孢杆菌菌株，具有优良的固氮性能。
本发明以所述为新的地衣芽孢杆菌菌株制备得到的菌剂为热带水果黄皮、蔬菜(尤其是油麦菜)等作物提供了一种优良的接种剂，它来源于黄皮植物组织中，可明显促进黄皮或蔬菜的生长、结实和提高黄皮对土壤病原微生物的抗性，可克服使用化肥使土壤酸化、不利于植物生长的缺陷。